在整形外科的临床实践活动中常常可以看到软组织缺失的情况，目前存在着两类能够作为软组织充填物的材料，首先是经过人工方式合成的正常肌理组织为主的临时性填充物，诸如胶原蛋白、透明质酸等，这些物质的良好生物相容性和可降解性让其应用范围广泛，但其填充效果却不能持续很长时间；其次是通过人工方式合成的惰性材料，诸如硅胶等，但这样的填充物等于异物植入，无法获得自然的整形术后效果。目前快速崛起的自体脂肪颗粒一直存在着较低的术后脂肪存活率，这无形之中让以最终填充效果为目标的手术次数增多。 近年来，以组织再生理论为基础的脂肪组织工程因为脂肪干细胞 （adipose stemcells，ASCs）的出现实现了飞跃，也让基于脂肪肝种子细胞为基础的脂肪组织工程日渐受到医学界关注。
本研究采用CXC-06法测定纤维蛋白胶对人 ASCs 的细胞毒性，旨在为基于纤维蛋白胶支架为基础的脂肪组织工程深化提供参考，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 试剂与仪器
上海昕瑞粗纤维测定仪CXC-06、胎牛血清（FBS）、低糖 DMEM 培养基、胰蛋白酶（Gibco）均购自美国 Gibco 公司；Ⅰ型胶原酶、纤维蛋白原、凝血酶（Sigma）购自美国 Sigma 公司；CCK-8 试剂购自日本同仁化学研究所；倒置相差显微镜购自日本 Olpmpus 公司， 型号为 CKX41；CO2 培养箱购自美国 Thermo 公司， 多功能酶标仪购自美国 Thermo 公司，型号为 Skan Spertrum。
1.2 研究方法
1.2.1 人脂肪干细胞的获取 选取 2018 年 11 月 12 日来我院进行成人吸脂术的某位 28 岁健康女性的术后废弃脂肪组织并从中得到人脂肪干细胞，本研究在医院医学伦理委员会和患者本人的授权下进行。将 5 ml废弃的吸脂术后人体脂肪组织与Ⅰ型胶原酶溶液混合，溶液浓度与脂肪组织相同且浓度为 1.0 mg/ml，简单摇匀后在 37℃的水浴箱内部静置消化 30 min，之后在离心机上按照 1000 r/min 的速度连续离心 5 min来消去表面油脂和液体。 利用 FBS DMEM 培养基来对细胞进行重悬，培养基的 FBS 浓度为 10%，细胞浓度设置为（5×105~10×105）个/L，然后将细菌接种到规格为 25 cm2的培养瓶中培养 48 h 再进行第一次液体更换， 融合度达到 80%后利用胰蛋白酶消化传代，传代数目为 3 代，完成后的干细胞留作后用。
1.2.2 纤维蛋白胶浸提液的制备 纤维蛋白胶浸提液的萃取参照 ISO 10993 医疗用具的生物学评价准则来进行。 将浓度分别为 50 mg/ml 和 500 U/ml 的纤维蛋白原溶液和凝血酶溶液按照等体积抽吸到双联注射器之中，并将其转注到 6 孔板上，令纤维蛋白胶在6 孔板底层均匀铺开。 将培养基加注到已经成型的纤维蛋白胶上，加入时材料表面积和液体体积之间的比值为 3 cm
2/ml，将在 37℃的孵化箱内部完成 3 d 浸提后形成的纤维蛋白胶百分百纯度浸提液和等量体积的 DMEM 培养基相融合， 并让浸提液的浓度降低到50%。 然后将 10%浓度的胎牛血清放置其中并按照4℃低温保存以备后用。
1.2.3 CCK-8 试剂测定各组培养液中吸光值 将制备的纤维蛋白胶制成不同浓度的纤维蛋白胶浸提液，分别为阴性对照组（DMEM 培养基）、50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤 维 蛋白 胶 浸 提液组和 阳 性对 照 组（DMEM 培养基，内含 6.4%苯酚溶液），完成细胞毒性检测。令第 3 代 ASCs 胰酶完成消化，之后按照 1×107/L的浓度制造细胞悬液，按照每孔 100 μl 的比例在 96 孔板中完成接种，24 h 以后提取培养完成的细胞贴壁并吸收废弃培养液。将制备的培养液分别添加到阴性对照组、50%纤维蛋白胶浸提液组、100%纤维蛋白胶浸提液组和阳性对照组 4 个分组中，4 个分组培养液均包括 5 个复孔配置， 细菌种版 2 个， 培养箱温度为37℃。 培养 24 h 和 72 h 时，将一块 96 孔板取出并对培养液进行吸收，每孔加入 10 μl CCK-8 溶液。 将培养板在培养箱内培养 2 h， 采用酶联免疫检测仪在450 nm 双波长处测得相应的吸光值（A 值）。
讨论
支架材料是搭建脂肪组织工程的重要环节，须满足包括优良生物相容性和固定时间段高降解特性等一系列性质。 在凝血反应的拟态之下，凝血酶与纤维蛋白原发生作用，产生了带有一定物理强度的胶状纤维蛋白胶（fibrin gel）。 将纤维蛋白胶作成多种组织架构的支架材料已经有了多次见诸报端的实例。然而，融入复合 ASCs 的纤维蛋白胶支架材料被用于搭建脂肪组织工程的研究范例还较为少见。 本研究中，ASCs 被按照酶消化模式从脂肪组织中萃取出来，采用 CCK-8 模式对这一物质进行体外培养后与纤维蛋白胶相融合产生的细胞毒性进行测试，结果显示纤维蛋白胶与 ASCs 相融合后并没有明显的毒性，从而为该物质与复合 ASCs 相容共同作为脂肪组织工程支架材料的探索提供了参考。
一般情况下， 组织搭建的工程思路是把支架材料和种子细胞的合成材料按照一定诱导模式植入人体，但这就需要种子细胞和支架材料两个关键性的东西。在 2001 年，Zuk 等第 1 次对基于脂肪吸取物培养而成的命名为 ASCs 的间充质干细胞特质种群进行报道。基于脂肪组织的大获取量和低获取难度， 将脂肪作为ASCs 的提取来源有着良好的实际潜力。 脂肪组织工程因为 ASCs 的出现而实现了飞跃，也让基于脂肪肝种子细胞为基础的脂肪组织工程日渐受到医学界关注。种子细胞在组织工程的环境下必须在三维支架上实现种植，这也让支架材料在构建组织的过程中起到了重要的作用。 支架可以基于塑型特质分为预塑型多孔材料和注射性凝胶材料，在脂肪组织工程的状态下，注射型凝胶支架搭建的注射型软组织填充物更具有常态化的优点，创面小、填充均匀、可以更好地完成对不规则缺失的填补。纤维蛋白原加上凝血酶造就的纤维蛋白胶其实就是凝血反应的最后拟态，水凝胶由纤维蛋白聚合而成， 注射填充的活动只需要双联注射器即可轻松完成。 良好的降解性让纤维蛋白胶在作为支架材料时可以拥有更好的组织工程潜力，在诸如平滑肌、骨骼、软组织等多个组织工程领域对纤维蛋白胶的利用探索已经多次出现在相关报道中。
生物相容性是测试任何机体植入材料的必须标准，而对这些机体植入材料的生物相容性的国际通用测试活动主要分三步：①基于体外培养细胞繁殖干扰力的体外细胞毒性检测；②测试材料对于机体的局部或全身毒性的动物实验；③病患活体实验。 这也让细胞毒性作用的测试成为了材料生物相容性测试的第一步，而测试细胞毒性的主要标准就是 CCK-8 标准。本研究存在 100%浓度液和 50%浓度液的纤维蛋白胶浸提液，检测时间均在培养活动的第 1、3 d 进行。 测试结果显示，两组浸提液的 A 值与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。 完成 24、72 h 培养时，50%及 100%纤维蛋白胶浸提液组、阴性对照组的 A 值均小于阳性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。通过 CCK-8 法测定各组各时段的 A 值， 结果显示，ASCs 下纤维蛋白胶不存在显著细胞毒性。
在脂肪组织工程内部应用纤维蛋白胶支架材料尚无足够研究实例，本研究也只是纤维蛋白胶在体外ASCs 内部所产生独行的 CCK-8 检测，未来对于纤维蛋白胶组织结构支架材料的实用安全研究还需要更加全面。
