昕瑞液相色谱荧光检测法测定水样中苯胺含量

导读:本研究基于苯胺分子在激发光照射下能够激发出特定荧光、热稳定性好等理化特征，在寻找和确定最优激发光波长和发射光波长的前提下，采用 HPLC 荧光色谱法测定苯胺，具有样品前处

来源：未知发布日期：2019-08-28 09:39【大中小】

昕瑞水质色度仪建立了一种测定水样中苯胺的高效液相色谱荧光检测法。样品经 HLB 柱进行固相萃取净化后，以 V ( 甲醇) ∶ V( 水) = 35 ∶ 65 的混合液为流动相，流速 0．8 mL/min，柱温 25 ℃，进样量 10．0 μL 条件下，使用 ZOＲBAX Eclipse Plus C18 色谱柱和荧光检测器进行液相色谱分析。结果表明，苯胺在 λex = 233 nm/λem = 344 nm 波长下响应值最高; 在 1．00～ 100．00 μg /L 间回归方程为 y = 10．342 8x+8．583 6，相关系数为 0．999 8，检出限为 0．022 μg /L，定量限为 0．073 μg /L; 空白水样中苯胺平均回收率为 94．26% ～ 99．45%，相对标准偏差为 0．97% ～ 1．27%; 实际水样中苯胺的平均回收率为 89．31% ～ 94．78%，相对标准偏差为 2．10% ～ 4．84%。该方法快速、简单，具有良好的准确度和精密度，适用于常规检测分析。

苯胺( Aniline) 是广泛应用于印染、医药和化工等工业领域的重要原料。苯胺具有致突变、致癌的作用，严重威胁人类健康，给生态环境造成极大危害，环保部早已将其列入优先控制的污染物黑名单，并在《地表水环境质量标准》( GB 3838—2002) 中规定了苯胺标准限值为 100 μg /L。目前检测水中苯胺的方法主要有分光光度法、电化学法、液相色谱法/质谱联用、气相色谱法/质谱联用等。电化学法和分光光度法灵敏度不高，不能广泛应用。采用液相色谱仪和气相色谱仪检测苯胺的方法均有报道，但大部分方法的样品前处理利用传统的液液萃取，不仅消耗大量的有机试剂，还操作繁琐，耗时耗力，样品用量大，回收率偏低。采用超高效液相质谱联用法进行分析检测，可大幅度提高分离速度和灵敏度，近年来在食品医药、环境等领域内应用广泛，但这些方法运行成本较高，实验室普及率较低，不能大规模推广应用。苯胺作为每年集中式生活饮用水地表水源地中的必测项目，主要采用气相色谱法进行测定，方法单一，样品用量大，检出限较高，目前国内还没有苯胺的液相检测标准。采用荧光检测器液相色谱法测定水中苯胺的报道较少，本研究基于苯胺分子在激发光照射下能够激发出特定荧光、热稳定性好等理化特征，在寻找和确定最优激发光波长和发射光波长的前提下，采用 HPLC 荧光色谱法测定苯胺，具有样品前处理操作快速简便、灵敏度高的优点，对饮用水、地表水和地下水等多种水环境中苯胺含量的检测具有指导意义。

1 材料与方法

仪器与试剂

上海昕瑞台式色度仪SD9012AP（上海昕瑞） ; 色谱柱 ZOＲBAX Eclipse Plus C18( 100 mm×4．6 mm， 3．5 μm，美国 Agilent 公司) ; 全自动固相萃取仪 AutoSPE-06( 中国Ｒeeko 公司) ; Milli-Q 超纯水机( 美国 Milli- pore 公司) ; 超声波清洗机 ULTＲASONIC CLEANEＲ PS-60( 中国超艺达科技有限公司) ; 溶剂过滤器( 1 L，天津市津腾实验设备有限公司) ; HPD-25 无油真空泵(天津市津腾实验设备有限公司) ; Eppendorf Ｒesearch plus 手动移液器 100～1 000 μL，30～ 300 μL( 德国 Eppendorf 公司) ; HLB 固相萃取柱(天津市津腾实验设备有限公司) ; 无水硫酸钠柱( 2 g /6 mL，中国 CNW 公司) ; 有机系滤膜( 0．45 μm，天津市津腾实验设备有限公司) ; 甲醇中苯胺标准溶液( 1 000 mg /L，环境保护部标准样品研究所)。

分析方法

水样的预处理取水样 500 mL，用 1 mol /L 氢氧化钾溶液调节 pH 至 11～12，并将水样过 0．45 μm的水系滤膜，待固相萃取。 1．2．2 固相萃取活化柱子: 先用 10 mL 甲醇以 3．0 mL /min 的流速预洗 HLB 柱，使溶剂流净，再用 10 mL水以 3．0 mL /min 的流速活化 HLB 柱。
样品的富集: 用 500 mL 水样以 10 mL /min 的上样速度流过已活化好的 HLB 柱进行样品富集。干燥: 先用 5 mL 水以 5 mL /min 流速淋洗 HLB 柱后，再用 5 mL 空气以 20 mL /min 流速推吹 HLB 柱，最后高纯氮气吹 HLB 柱 25 min，使柱干燥。洗脱: 先用 10 mL 甲醇以 40 mL /min 的流速清洗注射泵，再用 10 mL 乙酸乙酯以 1 mL /min 的流速洗脱HLB 柱，洗脱液再过无水硫酸钠柱，收集洗脱液。最后用 5 mL 高纯氮气 20 mL /min 推 HLB 柱，收集洗脱液。
定容: 将收集的洗脱液在 40 ℃条件下，氮吹浓缩至近干，加入 1．0 mL 甲醇，过 0．45 μm 的有机滤膜，待高效液相色谱仪测定。 1．2．3 检测条件色谱柱: ZOＲBAX Eclipse Plus C18( 100 mm×4．6 mm，3．5 μm) ; 检测器: Agilent G1321B 荧光检测器; 流动相: V( 甲醇) ∶ V( 水) = 35 ∶ 65，使用前用 0．45 μm 的有机滤膜进行过滤; 流速: 0．8 mL /min;柱温: 25±1 ℃ ; 荧光检测波长: 激发波长( λex ) 233 nm，发射波长( λem ) 344 nm; 进样量: 10 μL; 保留时间: 3．2 min; 外标法定量。

2 结果与讨论

前处理条件的选择

基质干扰主要产生于固相萃取分离过程中，调整色谱条件，如: 选择合适的 SPE 小柱、洗脱液和洗脱速度等，可降低基质干扰，提高待测物的回收率。
1 SPE 小柱的选择苯胺属于弱碱性化合物，极性较强，常用的 C18柱对苯胺吸附不完全，致使回收率偏低。HLB 柱通过一个“特殊的极性捕获基团”来增加对极性物质的保留，萃取效率高，能兼容 100%水相，同时可以耐受较宽的 pH 范围，本实验选择 HLB 柱作为净化富集柱。 2．1．2 洗脱液的选择本实验考察了用 10 mL 甲醇和乙酸乙酯分别作为洗脱液进行洗脱时苯胺的回收率。
结果表明，甲醇、乙酸乙酯分别作为洗脱液时，苯胺的平均回收率分别为 71．4%和 94．3%。乙酸乙酯的洗脱效果较好，因此本方法选择乙酸乙酯作为洗脱液。 2．1．3 洗脱时流速的选择本实验考察了用 10 mL 乙酸乙酯作为洗脱液在流速分别为 0．5，1．0 和 2．0 mL / min 进行洗脱时，空白水样中苯胺

的平均回收率分别为 85．6%，94．3%和 76．1%。洗脱流速为 1．0 mL /min 时，苯胺的平均回收率最高。洗脱速度过快，溶质在液固相间无法达到平衡，导致分离效率降低。洗脱速度过慢，溶质在液体中扩散，也导致分离效率降低。因此本方法选择 1．0 mL /min 作为洗脱流速。

荧光检测条件的选择

采用液相色谱荧光检测器的光谱扫描技术，对苯胺标准溶液的激发光谱和扫描光谱进行扫描，从而确定出检测苯胺的最佳激发波波长和发射波波长。首先由苯胺最佳紫外吸收波 230 nm 作为激发波长，对不同发射波长 λem进行全扫描检测，苯胺响应值最大时的发射波长 λem为 345 nm ; 然后将寻得的345 nm 作为发射波长( λem = 345 nm) ，对不同激发波长λex进行全扫描检测，苯胺响应值最大时的激发波长 λex 为 233 nm ; 最后再将寻得的 233 nm 作为最佳激发波长( λex = 233 nm) ，再次对不同发射波长 λem进行全扫描检测，验证性寻得苯胺响应值最大时的发射波长λem为 344 nm 。通过对不同发射波长条件下苯胺的响应值进行分析比较，最终确定苯胺的激发/发射波长为 λex = 233 nm /λem = 344 nm。

方法的线性关系和检出限

准确量取 1 mL 苯胺标准溶液( 1 g /L) 于 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度线，该贮备液中含苯胺 100 mg /L，摇匀备用。将苯胺的贮备液用甲醇逐级稀释至 1．00，5．00，10．00，50．00，100．00 μg /L，待仪器稳定后分别进样，10．00 μg /L 的标准色谱，然后分别以色谱峰面积( y) 为纵坐标，以浓度( x) 为横坐标作图，即为苯胺的标准曲线。苯胺的回归方程为 y = 10．342 8x+8．583 6，相关系数( Ｒ2 ) 为 0．999 8，表明苯胺在 1．00～100．00 μg /L 范围内仪器响应值与其浓度呈良好线性关系。配制 1 μg /L 苯胺标准溶液逐级稀释，按照本方法进行分析，分别以 3 倍和 10 倍信噪比( S /N) 计算方法的检出限和定量限［23］。苯胺的检出限为 0．022 μg /L，定量限为 0．073 μg /L，远低于 GB 3838—2002 规定的苯胺控制标准限值( 100 μg /L) 和 GB /T 5750．8—2006．37 中苯胺的方法检出限( 20 μg /L) 以及 HJ 822—2017 中苯胺的方法检出限( 0．09 μg /L) ，因此本方法可以满足水质分析监测的要求。
方法的准确度和精密度

空白样品加标回收试验量取空白水样 500 mL，添加苯胺标准溶液，分别至 10．0，100．0，500．0 μg /L，按照上述分析方法萃取、净化，并按照上述色谱条件各平行测定 6 次，测得 3 组平均加标回收率，空白水样中苯胺的平均回收率为 94．26% ～ 99．45%，相对标准偏差为 0．97% ～ 1．27%; 符合残留量分析检测的技术要求。

3 结论

本研究建立了一种测定苯胺在水体中残留量的高效液相荧光色谱分析法。结果表明，苯胺的液相色谱荧光检测条件最佳激发/发射波长( λex /λem ) 为 233 nm /344 nm。空白水样中苯胺平均回收率为 94．26% ～ 99．45%，相对标准偏差为 0．97% ～1．27%，实际水样中苯胺的平均回收率为 89．31% ～ 94．78%，相对标准偏差为 2．10% ～4．84%。该方法条件下的检出限为 0．022 μg /L，定量限为 0．073 μg /L。该方法对苯胺在水中的检测具有样品前处理过程操作简单、灵敏、快速的特点，其准确度、灵敏度达到水质分析监测的要求，适用于测定水环境中苯胺的残留量。

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导读:本研究基于苯胺分子在激发光照射下能够激发出特定荧光、热稳定性好等理化特征，在寻找和确定最优激发光波长和发射光波长的前提下，采用 HPLC 荧光色谱法测定苯胺，具有样品前处

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