三唑类杀菌剂为有机杂环类化合物，结构主链上含有羟基(酮基)、取代苯基和 1，2，4-三唑基团，作为一类高效、低毒、广谱的杀菌剂，广泛用于蔬菜、水果、稻谷作物等种植与病虫害防治，但同时也造成其在蔬菜、水果、农作物、土壤和水体中残留，影响食品质量安全并造成环境污染。残留的杀菌剂及其代谢物可通过食物链传递，在动物组织中富集、累积，使畜禽产品也存在安全隐患，对消费者的健康造成威胁。日本“肯定列表制度”及国际食品法典委员会(CAC)针对畜禽产品中的部分三唑类杀菌剂设定了最大残留限量(MＲL)，范围在 0．01 ～ 2．00 mg /kg 之间。我国食品安全标准 GB2763-2016 中仅规定了部分三唑类杀菌剂在植物性食品中的限量标准，尚未对动物性食品中残留作限定。目前，文献报道的关于三唑类杀菌剂残留的测定主要集中在水体、土壤及水果、蔬菜等植物性样品，样品 净 化 通 常 采 用 QuEChEＲS 方 法、固 相 萃 取 方 法 ( SPE )或分散液液微萃取法(DLLME)等，检测方法有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-质谱法(GC-MS)等。现行关于三唑类杀菌剂的检测技术标准涉及的基质以粮谷类、果蔬等植物性食品为主，净化方式均采用固相萃取技术，关于畜禽产品中三唑类杀菌剂的检测方法较少，缺乏相应完善的检测技术标准。对于动物性食品的残留分析方法通常采用较为繁琐的SPE 柱净化或 QuEChEＲS 法结合其它技术，Souza 等通过改良 QuEChEＲS 法结合冷冻除脂后用HPLC-MS /MS 和 GC-MS 检测肝脏、肌肉中的兽药和杀虫剂。吕冰等采用乙腈提取，以凝胶渗透色谱和 Carb-NH2 萃取柱联合净化，建立肉类、水产类等动物性食品中 167 种农药残留的气相色谱-串联质谱检测方法。本研究将针对猪肉、猪肝、猪脂肪基质中脂肪、蛋白含量高，采用通过式过柱法去除脂肪和磷脂，净化效率高、操作简便，结合超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS /MS)法测定，方法灵敏度高、重复性好，可以满足畜禽产品中三唑类杀菌剂的测定要求，为动物源食品的残留监测与控制提供技术支撑。
实验部分
2．1 仪器与试剂
上海昕瑞脂肪测定仪SZF-06A;UPLC-MS /MS 配置包括 LC 30AD 超高压液相色谱(日本 Shimadzu 公司)与 6500 QTＲAP 质谱(美国 Applied Biosystems 公司)，并配备 Multiquant 3．0 数据处理软件; 固相萃取装置(美国 Supelco 公司);Talboys230v 涡旋混合器(美国 Troemner 公司); SorvallPrimoＲ 高速冷冻离心机(美国 Thermo 公司);KQ5200B 超声波清洗器(昆山舒美超声仪器有限公司); 分析天平(德国 Sartorius 公司); TurbovapLV氮吹浓缩仪(瑞典 Biotage 公司); 组织捣碎机(荷兰 Philips 公司)。
固相萃取柱为 OasisPＲiME HLB(200 mg，6 mL，Waters 公司)。甲醇、乙腈(色谱纯，德国 Merck 公司)。甲酸铵(色谱纯，迪马公司)。实验用水为超纯水(美国 Millipore 公司)。三唑类杀菌剂标准品(纯度均≥98%，名称见表 1)购自德国 Dr． Ehrenstorfer GmbH 公司。准确称取按其纯度折算为 100%质量的 21 种三唑类杀菌剂标准品各 10 mg，分别用甲醇溶解并定容至 100 mL，浓度为 100 mg /L，储备液储存于!20℃，有效期为 12 个月。用空白样品提取液配成不同浓度的基质混合标准工作溶液，混合标准工作溶液保存于 4℃，现配现用。
结果与讨论
1 色谱-质谱条件优化
以 C18柱(100 mm×2．1 mm，1．7 μm，Waters 公司)为分离柱，比较了甲醇、乙腈作为流动相以及添加甲酸、甲酸铵对目标物分离行为及响应的影响。结果表明，采用甲醇-2 mmol /L 甲酸铵溶液(含 0．1%甲酸)作为流动相，梯度洗脱时，化合物分离效果及峰形较好，灵敏度高。所有目标物在 ESI+模式下能获得较高丰度的［M+H］+准分子离子峰。在选定的质谱条件下进行子离子扫描，选取信号最强最稳定的子离子作为定量离子，以多反应监测模式优化各种质谱参数，使化合物的准分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度达到最大。
2 样品前处理条件的优化
通过对比 21 种杀菌剂在不同提取次数下的回收率，发现 2 次以上的提取效果明显优于单次，其中腈苯唑、氟硅唑、戊菌唑和苯醚甲环唑的回收率提高了 19% ～28%(如图 2)，2 次提取与 3 次提取的回收率无明显提高。
3 基质效应
动物性产品中富含大量蛋白、脂肪等，在残留测定过程中易产生基质效应。不同基质对目标物离子化程度的影响存在差异。本研究分别比较相同浓度下，三唑类杀菌剂在猪肉、猪肝、猪脂肪空白基质提取液和溶剂中响应值的比值，计算公式为 ME(%)= B /A×100(A 为标准溶液响应值; B 为基质匹配标准溶液响应值)，当基质效应 ME 值大于或者小于 100%时，认为具有基质增强或抑制作用。应用优化后的方法，猪肉基质效应为 84% ～106%，猪脂肪的基质效应为 83% ～104%，猪肝对目标物离子化的影响较为显著，基质效应为 75% ～107%，同时对 21 种三唑类杀菌剂混合标准中间液制备基质标准工作曲线与同浓度梯度的溶液标准曲线也进行了比较，其斜率比值在 0．6～1．3 之间。为降低基质效应影响，用空白样品提取液配制基质匹配标准曲线进行定量分析。
4 方法的线性范围与检出限、定量限
在空白样品提取液中添加不同浓度的标准品(0．5、1．0、2．0、5．0、10．0、20．0、50．0 和 100．0 μg /L)，采用本方法测定，以峰面积为纵坐标，对应质量浓度为横坐标进行线性拟合，绘制基质匹配标准曲线，21 种三唑类杀菌剂在 0．5～100 μg /L 浓度范围内，线性关系良好，相关系数 Ｒ2＞0．99。
结 论
以猪肉、猪肝及其脂肪为研究对象，建立了 21 种三唑类杀菌剂的分析测定方法，样品经乙腈提取，浓缩后加少量水，采用 PＲiME HLB 柱去杂、UPLC-MS /MS 分析。方法前处理操作简便，灵敏度较高，有效减少了基质干扰，能够满足日本和 CAC 对该类杀菌剂的限量要求。同时，本方法也适用于畜禽产品中肝脏、脂肪和肌肉组织中三唑类杀菌剂的检测。
